艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：艱難梭狀芽孢桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Clostridium Difficile Probe PCR Kit

艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細菌，一般寄生在人的腸道內。如果過度服用某些抗生素，艱難梭菌的菌群生長速度加快，影響腸道中其他細菌，引發炎癥。該細菌會引起偽膜性腸炎，臨床表現為腹瀉、腹痛、伴有全身中毒癥狀，癥狀突然開始，并伴隨血壓低，嚴重時能致死。通常還伴有發燒，白細胞增多，之后可導致死亡，是很嚴重的一類疾病。該細菌還會引起抗生素相關性腹瀉，在體內的潛伏期為5-10天，之后導致大量的棕色或水狀腹瀉，持續1周左右。除上述疾病外，艱難梭菌尚可引起腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔及陰道感染、菌血癥和氣性壞疽等。近年來該菌已成為醫院內感染的病原菌之一，日益被人們所重視，因此快速檢測艱難梭狀芽孢桿菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測艱難梭狀芽孢桿菌的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據人艱難梭狀芽孢桿菌高度保守的VP1區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

6. 本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.       標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.      重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.      如果有N個樣品，最好設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.       用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數細菌DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

9.      如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。

10.       在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

五、數據處理

     12.     以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測

     13.      如果有必要電泳確認，可取10-20μL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環境，建議不輕易采納。