鴿源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：鴿源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒

本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有鴿的成分。現代食品加工工藝極大改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質地等特性，因此傳統的感官鑒別技術已經無法對食材的真偽進行準確的鑒定。同時部分食材還有致敏性，因此基于基因檢測的快速靈敏的食材來源檢測技術將對食品監管和安全提供重要的保障。本產品就是為滿足這一需求根據 PCR 原理開發的產品，它具有下列特點：

1.   即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA。

2.   根據鴿子16S rDNA基因保守區設計引物，能專一性地檢測出樣品中的鴿源成分，但不能檢測其他非鴿源的成分。

3.   熒光定量 PCR 檢測，比常規 PCR靈敏10-100倍。

4.   快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

5.   一管式閉管操作，降低了交叉污染。

6.   提供陽性標準品，便于分析實驗結果。

7.   對混合樣品中鴿源成分的檢測下限為 0.001%，對樣品中鴿源成分的核酸檢測下限為 0.1ng/μL。

8.   本產品只能用于科研，足夠 50 次 20μL 體系的熒光定量 PCR。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。最好在專門的區域操作。

【自備試劑】DNA 模板

【使用方法】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.  用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.  在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.  換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.  換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.  重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.  用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。

8.  如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：

9.  配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料管中加入 10

μL 溶液 A 成分一，20μL 溶液 A 成分二和 970μL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內用完，不要長期放置。一次檢測一個樣品需要 100μL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待測樣品數量為其他數字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應的調整。

10.  在標記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小）或 5μL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5μL 陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5μL 水。

11.  在每個管中加入 100 μL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

12.  95℃保溫 10 分鐘。

13.  待冷卻到常溫后加入 10μL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA

釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

14.  如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品（也充當 PCR 陽性對照）。如果做 2-3 次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。

15.  在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅 ABI7500、7700 和  7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

16.  蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qPCR（具體 PCR 參數可以根據 qPCR 儀器的不同而自行優化）。

四、qPCR 反應參數

五、數據處理

17. 以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log值，再推算出其濃度。

18.如果把試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間。則重復一次。重復試驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。