牛狂犬病毒(RV)ELISA試劑盒

                                                           (ELISA) 使用說明書

??？袢《?RV)ELISA試劑盒用于測定牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中狂犬病毒(RV)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中牛狂犬病毒(RV)表達(dá)。用純化的?？袢《?RV)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中狂犬病毒(RV)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的狂犬病毒(RV)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹DI洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中牛狂犬病毒(RV)的存在與否。

試劑盒組成

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.         編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

2.         加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.         配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.       終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.       測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

計算和結(jié)果判定：

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為牛口蹄疫3ABC抗體（FMDV-3ABC Ab）陰性

陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為牛口蹄疫3ABC抗體（FMDV-3ABC Ab）陽性

注意事項

1．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月